ヒト間葉系幹細胞（hMSC）から骨芽細胞に分化誘導できるキットです。

温熱刺激によるデキサメタゾン誘導性の筋萎縮の進行抑制効果について

投与されたステロイド剤は、細胞内に取り込まれますが、細胞内ではステロイドに特異的なレセプター(受容体)と結合しステロイド・レセプター複合体がつくられます。このレセプターの存在は、細胞内におけるホルモン作用の発現に必要な条件であり、レセプターの存在は細胞ではホルモン作用が発現しません。
ホルモンの作用は、レセプターの数と、ホルモンとレセプターの結合親和性によって決定されます。現在、臨床的に使用されている合成ステロイド剤はいずれも天然型のヒドロコルチゾンよりも生物学的活性が強いのですが、その理由として血中半減期の延長のほかこのようなレセプターに対する親和性の増強があげられています。例えば、デキサメタゾンの場合、ヒドロコルチゾンの約30倍の強さを持っていますが、レセプターとの親和性はヒドロコルチゾンの約8倍であり、自分の副腎皮質ホルモンの生産抑制の強さである血中半減期は約3倍です。

筋萎縮は，合成副腎皮質ホルモン：デキサメタゾン（10 µM）を培地に添加すること

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Coliテトラサイクリン耐性オペロンから得られた2種類の調節性因子、Tetリプレッサータンパク質（TetR）とTetオペレーターDNA配列（）を基にしたシステムで、哺乳類細胞において導入遺伝子発現を正確に調節する強力なツールである。Tet調節システムの性能を向上させたTet-Off AdvancedおよびTet-On Advanced Inducible Gene Expression Systemの開発により、その用途はさらに拡大した。
各システムは哺乳類細胞で効率よく働くよう最適化されている。（図1）

・Tet-Off Advanced / Tet-On Advanced調節ベクター
調節ベクターが発現するテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（tTA-AdvancedまたはrtTA-Advanced）は、TetRと3つのVP16活性化最少ドメインから構成される融合タンパク質である（1）。両システムのテトラサイクリン制御性トランス活性化因子は逆の作用を提供する。
すなわち、Tet-Off AdvancedシステムのtTA-Advancedは誘導物質ドキシサイクリン（Dox）非存在下でテトラサイクリン応答因子と結合して目的遺伝子の発現を高度に誘導し、一方、Tet-On AdvancedシステムのrtTA-AdvancedはDox存在下でテトラサイクリン応答因子と結合して目的遺伝子の発現を高度に誘導する。
・応答発現ベクター pTRE-Tight
プロモーター内に、反復配列をもつテトラサイクリン応答因子の改良型配列TRE-Tightをコードしており、トランス活性化因子との結合により目的遺伝子の発現を効率よく誘導する。
・Tet-Off Advancedシステムは、Dox非存在下で目的遺伝子を厳密に発現誘導する。
・Tet-On Advancedシステムは、Dox存在下で目的遺伝子を厳密に発現誘導する。

両因子を宿主ゲノムに組み込んだ二重安定発現細胞株は、Doxに対して容量依存的に応答するため、正確な調節下で目的遺伝子を発現させることができる（図2）。Tet-Advanced システムの最大発現レベルは非常に高くかつ正確にコントロールされている。樹立済みのTet-Advanced Cell Linesを利用すると安定発現細胞株の構築期間を大幅に短縮可能である（図3）。


[Tet-On Advancedの場合]


図1.

[PDF] 副腎皮質ホルモン剤 デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム注射液

Tet-Off Advanced / Tet-On Advancedシステムでの誘導発現
テトラサイクリン調節性トランス活性化因子タンパク質（tTA-AdvancedおよびrtTA-Advanced）は単純ヘルペスウイルスの3つの最小VP16活性化ドメイン（AD）にTetR由来のDNA結合ドメインを融合させた融合体で、哺乳類細胞内での発現に至適化されている。tTA-Advancedはドキシサイクリン非存在下で、rtTA-Advancedはドキシサイクリン存在下でTRE-Tightと結合し、下流遺伝子の転写を活性化させる。


図2.

デキサメタゾンとして静注・筋注1回1.65～6.6mg,3～6時間ごと。点滴静注1回1.65～8.3mg,1日1～2回。関節腔内注,滑液のう内注1回0.66～4.1mg,原則として投与間隔2週以上。軟組織内注1回1.65～5mg,原則として投与間隔2週以上。腱鞘内注1回0.66～2.1mg,原則として投与間隔2週以上。硬膜外注1回1.65～8.3mg,原則として投与間隔2週以上。脊髄腔内注・胸腔内注1回0.83～4.1mg,週1～3回。腹腔内注1回1.65mg。局所皮内注1回0.04～0.08mg,最大0.83mgまで,週1回。結膜下注1回0.33～2.1mg。球後注1回0.83～4.1mg。点眼1回0.21～0.83mg/mL溶液1～2滴,1日3～8回。ネブライザー,鼻腔内注,副鼻腔内注,喉頭・気管注,中耳腔内注,耳管内注1回0.08～1.65mg,1日1～3回。鼻甲介内注,鼻茸内注1回0.66～4.1mg。食道注1回0.83～1.65mg。以上,年齢・症状により適宜増減。〔多発性骨髄腫〕点滴静注ビンクリスチン硫酸塩,ドキソルビシン塩酸塩と併用。1日33mg,21～28日を1クールとし,第1～4日目,第9～12日目,第17～20日目に投与。投与量・投与日数は年齢・状態により適宜減量。〔抗悪性腫瘍剤投与に伴う消化器症状〕静注・点滴静注1日3.3～16.5mg,1～2回分割投与。最大16.5mgまで。

また、CYP3A4の誘導作用をもつ。 10.1 併用禁忌（併用しないこと）

カイコの3齢起幼虫に各濃度のRH5849とRH5992を含む人工飼料を投与し、24時間後に頭皮脱皮の有無を調べた。RH5849では10ppm処理区で100%、RH5992では1ppm処理区において90%の個体に頭皮脱皮が確認された。頭皮脱皮をした個体は、その後ほとんど摂食を停止し、その大部分が処理96時間後までに死亡した。

これまで唯一の非ステロイド骨格のエクジステロイドアゴニストとして知られていたジベンゾイルフェニルヒドラジンの代表例として、RH5849とRH5992の2化合物のエクジステロイドレセプター結合活性を調べた。その結果、RH5849は4.0×10⁶MのIC₅₀値、RH5992は3.0×10⁷MのIC₅₀値を示した。さらに、pHSP27-LUC法を用いて遺伝子発現活性についても調べたところ、両化合物により、最大43倍以上のルシフェラーゼ誘導活性が認められ、RH5849は2.0×10^-5MのEC50値、RH5992は3.0×10^-6MのEC₅₀値を持つことが明らかとなった。また、Kc細胞におけるエクジステロイド特有の形態変化である突起形成を指標とした活性の評価も行った。この場合、RH5849は4.0×10^-6MのEC₅₀値、RH5992は3.0×10^-7MのEC₅₀値を示した。

デキサメタゾン (池田薬品工業), デキサメタゾン (長生堂製薬) 商品一覧 ..

Tet-On Advanced / Tet-Off Advancedシステムによるルシフェラーゼ遺伝子の発現調節をウェスタンブロッティングで検証
Tet-On AdvancedまたはTet-Off Advanced調節因子を安定に発現するHEK 293細胞にpTRE-Tight-Lucプラスミドを導入し48時間後、Doxの存在、非存在下でルシフェラーゼの発現レベルを確認した。それぞれの誘導条件下では高いルシフェラーゼ発現が見られ、非誘導条件下での発現はほとんど見られなかった。（β-actinは内部コントロールとして使用）


図3.

以上の結果より、エクジステロイド活性物質の解析および探索に活用できる、効率的かつ高感度な活性評価系が確立されたことが示された。

おいて、デキサメタゾンは CES1 を誘導することが報告されているが[4]、ヒト胎児 ..

ヒト間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells、hMSC）に特化した著書は非常に少なく、研究機関などの関係者の方々から「hMSCに特化したテキストが欲しい」との声をいただき、『間葉系幹細胞ハンドブック～分離・培養・特性解析、再生医療への応用～』を発刊しました。組織からの間葉系幹細胞の分離培養から、拡大培養、分化誘導、その他の応用について、操作方法を中心に説明した実用的な書籍です。担当者ならおさえておきたい留意点やノウハウが満載です。

未分化維持/分化誘導試薬 · 分化誘導試薬（肝細胞）; デキサメタゾン

Tet調節性発現系の作製
一般的にTet-On／Tet-Off Advanced二重安定細胞株を作製するには、トランスフェクションを2回連続して行う。最適な誘導能と低バックグラウンドを確実にするために、各トランスフェクションの後には複数のクローン細胞株をスクリーニングする。樹立済みのTet-Advanced Cell Linesを利用すると安定発現細胞株の構築期間を大幅に短縮可能である。

ではデキサメタゾン (Dex) 誘導性筋萎縮に対するカルノシンの効果を検証するため、 C2C12筋管細

キイロショウジョウバエのhsp27遺伝子はエクジステロイド応答性遺伝子であることから、この遺伝子の転写開始点からエクジステロイド応答性部位までを含む5’上流域約0.67kbを、ホタル(Photinus pyralis)のルシフェラーゼ構造遺伝子に接続して、発現活性検出用ブラスミドpHSP27-LUCを構築した。pHSP27-LUCのDNAを高純度に調製し、エレクトロボーレーション法によりKc細胞に導入した。遺伝子導入されたKc細胞をエクジステロイドの存在下または非存在下で24時間培養後、細胞抽出液を調製し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターを用いて測定した。さらに、BCA法にて各抽出液のタンパク質濃度を測定し、ルシフェラーゼ活性に補正を加えた。20-ヒドロキシエクダイソンおよび-エクダイソンについてそのルシフェラーゼ誘導活性を調べたところ、それぞれ2.0×10⁷Mおよび2.0×10^-5Mで約80倍の誘導活性が認められ、EC50値はそれぞれ3.0×10^-8Mおよび2.0×10^-6Mであった。再現性も高く、20-ヒドロキシエクダイソンに対して、4.0×10^-9Mまで誘導が認められたことから、5ng程度の同ホルモンの検出が可能で、エクジステロイドアゴニスト活性評価系としては、最高レベルの感度にあることが判明した。

デキサメタゾン誘導筋萎縮モデルマウスの血中ホルモン濃度に対する加味四物湯（同時投与）の効果

エクジステロイドレセプター結合活性評価系とエクジステロイド応答性遺伝子発現活性評価系を活用して、新たなエクジステロイドアゴニストの母核化合物を探索した。約1,500点の化合物に対して、一次スクリーニングとして90点のサンプルを一度に測定できるレセプター結合活性評価系を用いて評価を行った結果、約50点にレセプター結合活性が認められた。さらに、二次スクリーニングとしてpHSP27-LUC法を用いてこれらの化合物について遺伝子発現活性を調べたところ3,5-di-tert-butyl-4-hydroxy-N-isobutyl-benzamide(DTBHIB)に明らかなルシフェラーゼ誘導活性が確認された。

コラーゲンペプチドPro-Hypのデキサメタゾン誘導性筋萎縮抑制作用

チトクロームP450（CYPs）は、様々な内因性物質や汚染物質、環境物質、薬物などの生物異物を代謝するヘム－チオラートモノオキシゲナーゼです。これらの酵素は、多くの薬物の代謝にとって必須であり、その誘導は薬物複数回投与時の薬物動態に影響を与える要素の一つです。特にCYP2C9は、ヒト肝臓中のP450酵素CYP2Cサブファミリーの主要なメンバーで、糖尿病薬トルブタミドなど全処方薬の約20％を代謝します。CYP2C9遺伝子の生物異物誘導はPXRやCAR、HNF4α、GRαなどの核内レセプターとの相互作用を介して転写レベルで制御されています。CYP2C9は、遺伝子プロモーター内のグルココルチコイド応答エレメント（GRE）とヒトグルココルチコイドレセプター（GRα）が直接結合することで強く誘導されます。CYP2C9誘導または阻害候補物質の早期のスクリーニングを行うことで、薬剤の毒性や効能の低さが原因で薬剤開発に支障が生じることを防ぐことができます。

この作用には免疫細胞がアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘導させることが関係しておる。 ..

HEK 293細胞においてTet-On Advanced rtTAのドキシサイクリンに対する感度はTet-On rtTAより10倍増加
pTet-OnまたはpTet-On Advancedのいずれかにより形質転換した2種類の安定なHEK 293細胞株にpTRE-2 Luciferaseを一過性にトランスフェクトした。細胞を指示濃度のDoxで処理し、トランスフェクションから48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

Tet-On Advanced rtTAタンパク質の向上した安定性は、ホストクローンの作製とスクリーニングのプロセスを容易にする。pTet-On Advancedのトランスフェクションにより、強力な誘導能を持つクローンを高頻度に産生できる（図5）。Tet Advanced Systemにより理想的なクローン細胞株の樹立を実質的に確実にすることが可能である。
また、pTRE-Tightと至適化したTet-On Advanced rtTAタンパク質の組み合わせは、バックグラウンドの発現を効果的に消去し、Doxの存在下で高い誘導能を実現する（図6）。Tet-On Advancedの発現誘導レベルはオリジナルのTet-Onよりもおよそ10倍高くなり、通常は1,000～2,000倍のオーダーとなる。


図5.

(C2C12筋管細胞においてモリンはデキサメタゾン誘導性の酸化ストレスと筋萎縮を抑制

DTBHIBの解析を詳細に行った結果、そのエクジステロイドレセプター結合活性は、6.0×10^-6MのIC₅₀値であること、エクジステロイド応答性遺伝子発現活性については、pHSP27-LUC法でEC₅₀値は8.0×10^-6Mであり、DTBHIBは3.0×10^-4Mで対照(無処理)の15倍のルシフェラーゼを誘導することが判明した。次項に示す発現活性検出用のpDAChE-LUCをKc細胞に導入する方法でも5.0×10^-6Mで4倍のルシフェラーゼ誘導活性が見られた。また、DTBHIBはKc細胞に対するエクジステロイド特有の形態変化である突起形成の誘導活性も示し、そのEC₅₀値は3.0×10⁶Mであった。

骨誘導性をもつ化合物デキサメタゾンを含有する複合多孔質足場材料、および、その製造方法

（株）バイオ未来工房の製品のみで、幹細胞の分離から、各細胞への分化誘導・確認まで行えます。
（）内の英数字は商品コードを示します。商品コードが記載されている製品については、製品名をクリックすると各製品の詳細をご覧になれます。

CYP3A誘導剤との併用により、本剤の活性本体ネツピタントの血漿中濃度が低下するおそれがある。 CYP3Aで代謝される薬剤

Tet-On Advanced Systemは高い誘導レベルを実現するHEK 293安定細胞株を多量に産生
HEK 293細胞にpTet-OnまたはpTet-On Advancedのいずれかを脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。G418による抗生物質選択に続いて、各トランスフェクションからそれぞれ36個のコロニーを単離し、培養した。次に各細胞株にpTre2-Luciferaseを一過性にトランスフェクトし、Dox 1μg/mlで48時間処理を行うか、または未処理のままとした。続いて細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定し、誘導が50倍以下、50倍以上、又は100倍以上の群に分類した。各値は50倍以上及び100倍以上まで増加した総コロニー数の割合を示している。


図6.

dexamethasone-induced 【形】デキサメタゾン誘導［誘発・誘起・起因］（性）の、デキサメタゾンに（よって..

細胞：HepG2細胞（50,000 cells/well）
刺激物質：Dexamethasone
刺激時間：24、48、72時間